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                    細胞形態觀察服務

                    簡要描述:細胞形態觀察服務是達為科生物的基礎服務項目之一,由細胞平臺經驗豐富的實驗人員操作完成。

                    • 更新時間:2022-12-23
                    • 瀏覽次數:1322

                    詳細介紹

                    (一)倒置顯微鏡下直接觀察細胞形態

                    細胞形態變化包括:細胞核、細胞膜和細胞質的改變,即細胞是否有空泡積累和脂質小滴、是否可見細胞膜膨出(鼓泡)、細胞核染色質的變化以及細胞器如線粒體、溶酶體等的變化、細胞脫壁和貼壁、細胞膜表面是否毛糙無光澤、細胞是否裂解為碎片等。通過細胞形態的這些變化,可直觀快速地判斷細胞毒性。

                    (二)透射電子顯微鏡觀察

                    【材料】

                    1. 2%~3%瓊脂糖。

                    2. 2%~2.5%戊二醛。

                    3. 1%四氧化*。

                    4. 0.2M PBS緩沖液。

                    5.梯度丙酮。分別為50%,70%,90%,100%濃度的丙酮。

                    【方法】

                    1.收集對數生長期的培養細胞5x107左右。將細胞連同培養液放入2ml的離心管中,然后用PBS清洗2~3次,1000~1500r/min離心樣品5~10分鐘,吸去上清液,混勻細胞。

                    2.沿管壁小心加入2%~2.5%的冷戊二醛,輕輕吹打,使細胞混勻。在4℃的環境中固定30分鐘,然后用指彈法將細胞團塊彈散,繼續用新的固定液固定細胞30分鐘。1000r/min離心5分鐘,棄上清液。

                    3.在4℃下用PBS沖洗后放置1~2小時或者過夜,離心后棄上清液。

                    4.管內加入0.1~0.5m1 37℃的2%~4%的瓊脂糖液,混勻并冷卻,形成細胞瓊脂凝膠預包埋塊。

                    5.離心管中加入少量的PBS或者75%的乙醇,用鋁片沿管壁小心地將細胞瓊脂糖松動,預包埋塊移到含有75%乙醇的青霉素瓶中,一天后換固定液一次。4℃保存。

                    6.將預包埋塊切成1 mm3大小,放到1%四氧化*中4℃固定1~ 2小時。用PBS反復漂洗后放置30分鐘或過夜。

                    7.分別用50%,70%,90%,100%的丙酮脫水一次,每次10~15分鐘;然后100%丙酮脫水3次,每次30分鐘。

                    8.浸入稀釋包埋劑(丙酮:包埋劑=1:1)中,室溫1小時。再放到純包埋劑中,37℃過夜。然后60℃固定48小時。放置于干燥器中備用。

                    9.將樣品放到電子顯微鏡進行透視觀察。

                    (三)掃描電子顯微鏡觀察

                    培養細胞電鏡掃描觀察非常方便;在觀察鐵壁細胞時也需要進行消化,制備成細胞懸液后,用Hanks液漂洗1到2次后,除去細胞碎塊和血清蛋白,以防妨礙觀察。

                    【材料】

                    1. 1.5%戊二醛。

                    2. 0.2M PBS緩沖液。

                    3. 50%,70%,90%,95%,100%的梯度乙醇。

                    4. 1%四氧化*(Os04)。

                    5.丙酮。

                    【方法】

                    1.單層細胞蓋玻片培養物冷漂洗后,用1.5%戊二醛4℃固定1~2小時。PBS液清洗3次,每次10分鐘。

                    2.在4℃下用1 % OSO4固定1小時,然后用PBS緩沖液清洗3次,每次10分鐘。

                    3.分別用50%,70%,90%,95%,100%的乙醇依次脫水,每個濃度的乙醇脫水2次,每次15分鐘。

                    4. 100%丙酮脫水3次,每次30分鐘。

                    5.將標本在4℃下用丙酮保存。

                    6.用掃描電子顯微鏡觀察。

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